ELISA检测鞭毛虫抗体流程，elisa检测鞭毛虫抗体的常见问题

摘要：本文介绍了一种使用ELISA检测鞭毛虫抗体的流程。从样本中提取DNA或RNA，然后通过PCR扩增目标基因。将PCR产物连接到载体上，并通过酶切和连接反应进行纯化。将纯化后的载体与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物，并通过ELISA方法检测其活性。该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，适用于鞭毛虫的快速诊断和研究。

ELISA检测鞭毛虫抗体的一般流程

1. 样本采集与处理
   • 血清：采集血液，待血液凝集（至少半个小时）后取血清。若不能马上进行试验，可将血清放于-20℃保存，但应避免反复冻融。在使用前需确保血清没有沉淀，若有沉淀应再次离心。
   • 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10 - 20分钟后，离心20分钟左右（2000 - 3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶（HRP）的活性。
   • 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000 - 3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
   • 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集，离心20分钟左右（2000 - 3000转/分），仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2 - 7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右，通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
   • 组织标本：切割标本后，称取重量，加入一定量的PBS（PH7.4），用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2 - 8℃的温度，加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分，分装后一份待检测，其余冷冻备用。标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
2. 板包被
   • 将检测的一个成分与包被板结合，通常是通过被动吸附完成。如果是用于抗体检测，像ELISA间接法那样使用纯化抗原，或像ELISA夹心法那样使用捕获抗体，来制备具有选择性的包被板。包被板的类型大多数是聚苯C2H4或聚苯C2H4衍生物，其具有不同的结合特性，这取决于目标物质和检测的性质。一些目标物质，包括重度糖基化的蛋白质、碳水化合物、DNA、脂类、短肽和有洗涤剂的蛋白质，是不能很好吸附的。
3. 孵育
   • 将试剂加入ELISA板后，进行孵育，以便有时间进行结合或反应。每次孵育的温度和时间将取决于检测步骤和正在进行的操作，通常在样品应用之后，于37℃下孵育1小时。
4. 洗涤
   • 在应用检测每个组成部分之间，直到结果测定前都要进行洗板。溶液从孔中排空后，通常使用磷酸盐缓冲盐水 - 20（PBST）做为缓冲液清洗孔，以去除任何残留的未结合抗原、抗体或试剂。可以用多通道移液器手工完成，或使用自动洗板机。不充分的清洗可能会导致高背景信号，而过多的清洗会导致样品信号低，不一致的清洗可能会导致整个板块的不一致，从而导致不可靠的结果。
5. 阻断
   • 在用蛋白质包被ELISA板后，阻断通常是必要的，以防止在接下来方案步骤中测定抗体的任何非特异性结合。与检测无关的混合蛋白被添加到板中并进行孵育，占据任何可用的非特异性结合位点。常见的蛋白质阻断缓冲液选择包括脱脂干乳、牛血清白蛋白（BSA）和酪蛋白。另外，非离子洗涤剂，如Tween20或TritonX - 100，可作为阻断剂使用，但不能像蛋白质那样提供永久性阻断。
6. 抗体加入
   • 选择正确的抗体至关重要，单克隆抗体和多克隆抗体都可以使用，它们都有各自的优缺点。单克隆抗体提供高特异性，但成本较高。使用采用二级抗体的方法增加了额外的步骤，延长了检测时间，增加了出错机会，需要多优化来找到合适的兼容抗体对。然而，使用多克隆二级抗体所带来的灵敏度提高可能使其成为一种值得或必须的有效检测方法发展方向。
7. 测定
   • 常见的是利用酶介导的可见颜色变化化学反应，然后可以用紫外 - 可见分光光度法测量，根据颜色变化或吸光度值来判定结果。

ELISA检测鞭毛虫抗体的灵敏度

ELISA检测鞭毛虫抗体的特异性

ELISA检测鞭毛虫抗体的常见问题

ELISA检测鞭毛虫抗体的注意事项