如何检测养殖水体中的霍乱弧菌：养殖水体中的霍乱弧菌（v.cholerae）

摘要：养殖水体的卫生状况直接关系到动物的健康和生长。本文介绍了如何利用实验室方法来检测养殖水体中的霍乱弧菌（V. Cholerae），包括样品采集、培养和鉴定等步骤。通过采样技术获取水体样本，然后将其接种在选择性培养基上进行培养。通过形态学特征和生化反应来确认霍乱弧菌的存在。这种方法不仅提高了养殖水质监测的准确性，也有助于及时采取控制措施，保障水生动物健康。

养殖水体中霍乱弧菌的检测方法

一、传统培养检测法

1. 增菌培养
   • 称取检样（如水体中的样本或其他相关样本）25g，加入装有225mL碱性蛋白胨水(APW)的广口瓶内。如果是固体样品应以均质器9000r/min - 10000r/min打碎，或以剪刀充分剪碎。然后在(36±1)°C培养6h - 8h和16h - 24h。若为牡蛎样品，应同样制备另一份检样，置于APW中，42°C培养6h - 8h和16h - 24h。
2. 分离培养
   • 以3mm - 5mm接种环取6h - 8h和16h - 24h增菌培养液的表面生长物一环分别划线接种于TCBS琼脂平板至少各一个，于(36±1)°C培养18 - 24h。在TCBS琼脂上，典型的霍乱弧菌菌落为大的，光滑，黄色，稍平，具有不透明中心和半透明的边缘。
3. 初步鉴定
   • 用接种环挑取TCBS琼脂平板上2 - 5个可疑菌落，划线于T1N1琼脂平板上，(36±1)°C培养12h - 18h。
   • 以无菌白色滤纸沾取T1N1琼脂表面培养物，滴加氧化酶试剂进行氧化酶试验。
   • 以无菌环取氧化酶阳性的培养物于0.5%去氧胆酸钠液试剂滴中，进行粘丝试验。
   • 以接种针取氧化酶和粘丝试验阳性的培养物，接种TSI、KIA和AGS，穿刺底层并划线斜面。
   • 以接种针取上项相同培养物接种T1N0和T1N3肉汤。
   • 将TSI、KIA、AGS、T1N0和T1N3肉汤于(36±1)°C培养18h - 24h。

二、胶体金法

1. 细菌处理
   • 通过高速离心或破壁等方法将水体中的细菌样品处理，使其裂解释放出胞内物质。
2. 反应
   • 将处理好的样品和标记有抗体的胶体金溶液混合，静置反应一段时间。
3. 分析结果
   • 观察反应混合物的颜色变化，判断是否有霍乱弧菌样品。这种方法操作简单、迅速，能够快速检测到霍乱弧菌等靶向分子，但操作流程受质量等因素影响较大，且检测结果仅能表明有无靶向分子存在，无法鉴定分离出的细菌属种和种类。

三、聚合酶链反应法（PCR法）

1. 普通聚合酶链反应法
   • 核酸扩增技术，即聚合酶链式反应(PCR)，其基本原理是设计、合成两条寡核苷酸，作为引物，对应于待测病原微生物（霍乱弧菌）某一段特异性序列的两端，然后在体外模拟DNA体内复制的过程反复扩增，使靶序列放大上万倍甚至上百万倍而被检测出来。一般选择霍乱肠毒素(cholera enterotoxin，CT)基因ctx的保守序列作为靶基因。不过一些非产毒株（如环境来源的菌株）有可能通过基因水平转移获得毒力基因成为产毒株，若仅检测ctx基因容易造成漏检。因此，霍乱弧菌的其他重要基因，如毒力协同调节菌毛A基因(tcpA)、o抗原基因(rfb)、外膜蛋白基因(omp)以及毒力相关基因等也可作为检测靶点进行综合检测。

四、双重微滴数字PCR法（适用于贝类养殖水体相关检测，对养殖水体中霍乱弧菌检测有一定参考意义）

1. 原理
   • 本方法采用的微滴数字PCR技术是基于实时荧光PCR技术基础上发展而来的，而且灵敏度更高。通过对霍乱弧菌相关基因的特异扩增，来实现对霍乱弧菌的检测。这种方法可以通过高通量技术来提高检测速度，从而降低人工成本，解放劳动力。利用该方法还可以同时检测贝类养殖水体中可能存在的副溶血性弧菌，并初步确认其比例，这对指导水产品加工企业进行进出口贸易，保证产品品质具有重要的意义，同时也有助于对养殖水体整体的微生物污染情况进行评估。

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