活菌数检测方法详解：新型活菌计数法的优缺点

活菌数检测方法主要包括以下几种：平板计数法，稀释涂片法和荧光染色法。其中平板计数法适用于细菌的计数，而稀释涂片法则适用于真菌的计数；荧光染色法则可以对活菌进行直接的染色，从而进行计数。每种方法都有一定的优点和缺点，需要根据具体需求选择合适的方法。

一、基于平板培养的活菌计数法

• 平板菌落计数法
  • 操作过程：将待测样品经一系列10倍稀释，选择三个稀释度的菌液，分别取0.2ml放入无菌平皿，再倒入适量已熔化并冷至45℃左右的培养基，与菌液混匀，冷却、待凝固后，放入适宜温度的培养箱或温室培养，长出菌落后计数。也可将稀释的菌液取0.2ml加到已制备好的平板上，然后用无菌涂棒将菌液涂布整个平板表面，放入适宜温度下培养，计算菌落数。按公式“每毫升原菌液活菌数 = 同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数×稀释倍数×5”计算原菌液的含菌数。这种方法能测出样品中微量的菌数，是教学、科研和生产上常用的一种测定细菌数的有效方法，可用于土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含细菌、酵母、芽孢与孢子等的数量测定，但不适于测定样品中丝状体微生物，例如放线菌或丝状真菌或丝状蓝细菌等的营养体等。操作不熟练可能造成污染，或培养基温度过高损伤细胞等原因会造成结果不稳定。
• 稀释涂布平板法
  • 操作过程：倒平板（将肉膏蛋白胨琼脂培养基，高氏Ⅰ号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基加热溶化，待冷至55 - 60℃，高氏Ⅰ号琼脂培养基加入10%酚数滴，马丁氏琼脂培养基加入链霉素溶液），然后进行样品的倍比稀释，将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数算出培养物中的活菌数。此方法广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。如果发现有杂菌，需要再次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

二、其他传统活菌计数法

• 计数器测定法（血细胞计数器计数法）
  • 操作过程：取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观看计数。由于计数室的容积是固定的，因而依据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。该方法简便易行，可立即得出结果，不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。
• 电子计数器计数法
  • 工作原理：测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌，所以要求菌悬液中不含任何碎片。
• 比浊法
  • 原理：细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以可用光电比色计测定菌液，用光密度（OD值）表示样品菌液浓度。
  • 特点：简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。另外，实验测量时一定要控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。
• 测定细胞重量法
  • 湿重法：单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重。
  • 干重法：单位体积培养物经离心后，以清水洗净放入干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。
• 测定细胞总氮量或总碳量法
  • 原理：氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。这种方法适于细胞浓度较高的样品。
• 颜色转变单位法（CCU法）
  • 适用对象：通常用于很小，用一般的比浊法无法计数的微生物，比如支原体等。
  • 原理：以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计数微生物的相对含量。例如解脲脲原体的操作，需取12只无菌试管等一系列操作来计数。

三、新型活菌计数法

• 基于基因表达活性的qPCR法（定量逆转录PCR法）
  • 操作过程：信使RNA（mRNA）首先通过逆转录酶转录成互补DNA（cDNA），随后，以cDNA为模板进行qPCR反应。可以选取微生物特定基因的mRNA作为检测靶标，对样品中的活菌数目进行测定。
  • 特点：具有灵敏度高、特异性强、快速的优势；但样品制备过程中的微小变化，都会影响最终的测定结果，对实验环境和操作人员的要求较高。同时，还需要根据不同的微生物，制定不同的检测靶标和对应标准。
• 流式细胞分选技术
  • 原理：在染色或荧光标记的基础上，可以使用流式细胞分选技术对细菌进行计数。此技术已成为生命科学领域的常见实验手段之一。
• 拉曼光谱检测方法
  • 原理：基于拉曼光谱效应（入射光照射在介质上时，与介质的分子或原子发生了能量交换，散射出来的光与入射光的振动频率不同），可从分子水平上，精确反映样品的化学成分组成和分子结构差异。表面增强拉曼光谱技术、共聚焦显微拉曼光谱技术的出现，使得其在分析鉴定过程中，更加直观、易于观察和控制，并且结果更加显著。不过该技术还在研究之中，目前仍有一些问题需要克服，有许多研究人员正在积极克服这些局限性，有望成为替代培养法的新一代活菌数检测方法。
• 基于细菌产物检测的方法
  • 原理：益生菌在生长和发酵过程中，可能会分泌一些物质或放出一些气体，在这些生物标记物的基础上，可以通过检测活菌产生的分泌物或气体的量，间接确定活菌的数目。这种新型的检测方法想象空间巨大，但目前仍然很不成熟，并且利用生物标记物区分死活菌的标准仍不全面。

活菌计数法的误差来源

活菌计数法在食品检测中的应用

新型活菌计数法的优缺点比较

活菌计数法的未来发展趋势